組織固定液對核酸品質的影響，由影響最弱至最強排列為何？① 10% buffered neutral formalin ②paraformaldehyde ③Carnoy's fixative ④Bouin's fixative

本題觀念：

固定液依其化學成分可分為交聯性（aldehyde 系）與沈澱性（alcohol–acid 系）兩大類，交聯性固定液透過甲醛分子在蛋白質/核酸上形成甲烷橋（methylene bridge），使組織結構「固定」但也改變核酸化學結構；沈澱性固定液則以酒精、酸或有機溶劑使蛋白質變性沉澱，同時可造成核酸的酸水解（depurination）或脫水性斷裂。核酸品質評估常以 PCR 產物可擴增長度、DNA 完整度指標（DIN/RIN）、以及擴增成功率等指標衡量。

選項分析

• 選項① 10% Neutral Buffered Formalin
  • 4% formaldehyde 在中性緩衝條件下緩慢穿透並交聯蛋白質與核酸，對組織形態學保留佳，分子檢測的 PCR 成功率亦高達約 98% （與 20% formalin 比，10% NBF 的靶向定序成功率顯著較佳）(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。
  • 交聯後雖有核酸修飾、斷裂，但因緩衝 pH 接近生理，酸水解作用輕微，整體對核酸品質影響最弱。

• 選項② Paraformaldehyde
  • Paraformaldehyde（PFA）實為高聚甲醛，溶解後釋出純甲醛進行交聯；無甲醇作為 stabilizer，因此生成的甲烷橋更純粹且交聯效率更高，導致核酸化學鍵改變、斷裂機率增加。
  • 與 10% NBF 相比，PFA 交聯更徹底，核酸抽提後 PCR 可擴增片段長度通常低於 NBF 處理組織，對核酸品質的影響略大(thermofisher.com)。

• 選項③ Carnoy’s Fixative
  • 含 60% ethanol、30% chloroform、10% acetic acid，屬沈澱性固定；acetic acid 造成酸性環境，易引發 depurination，且 ethanol 脫水亦可導致雙股斷鏈。
  • 雖某些研究指出 Carnoy’s 對短片段核酸（≤ 1 000 bp）抽提後完整度優於 formalin，但其酸性與脫水特性造成的化學斷裂與片段化風險仍高於純交聯固定液，對核酸品質影響次之(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。

• 選項④ Bouin’s Fixative
  • 由 25% formaldehyde、70% picric acid、5% acetic acid 組成，pH 約 2 左右；強酸環境導致嚴重 depurination、核酸片段化與降解。
  • 文獻指出 Bouin’s 處理組織要成功 PCR 擴增須將片段縮小至 DNA 100–200 bp、RNA < 80 bp，且須復原重建程序才能檢測(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)，影響最劇烈。

由上述對各固定液對核酸的「化學交聯/酸水解/脫水」機轉比較，可確認影響程度由弱到強為：① 10% NBF < ② PFA < ③ Carnoy’s < ④ Bouin’s。

答案解析

10% Neutral Buffered Formalin 以中性緩衝減少酸性水解，僅造成部分甲烷橋交聯，核酸斷裂最少；Paraformaldehyde 產生更純粹甲醛交聯，核酸修飾與斷裂稍多；Carnoy’s Fixative 的 acetic acid 與 ethanol 脫水造成酸水解與脫水性斷鏈，對核酸影響又更大；Bouin’s Fixative 含強酸 picric acid，會嚴重 depurination，核酸品質最差。因此由影響最弱至最強排列為 ①②③④，對應選項 A。

核心知識點

• 固定機轉：
– 交聯性固定劑（formaldehyde、paraformaldehyde）：甲醛交聯蛋白與核酸，形成 methylene bridge，改變化學結構、造成斷裂。
– 沈澱性固定劑（alcohol–acid 系如 Carnoy’s）：蛋白質脫水沉澱、acid hydrolysis，引發 depurination、斷鏈。
– 酸性與多組分混合固定劑（Bouin’s）：強酸環境＋交聯，核酸高階結構與化學鍵重度破壞。

• 核酸品質指標：PCR 可擴增片段長度、DIN/RIN、擴增成功率。

• 常用固定液對比：
– 10% NBF：PCR 擴增成功率≥ 98%，最佳分子檢測平衡固定效果與保留形態(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。
– PFA vs NBF：PFA 交聯更完全，核酸品質略差於 NBF（無甲醇緩衝導致更強交聯）(aatbio.com)。
– Carnoy’s：含 acetic acid，depurination 風險高於 aldehyde 固定，可抽提長度達 977 bp，但 acid–脱水造成斷鏈風險仍高於交聯劑(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。
– Bouin’s：強酸性造成嚴重 depurination，核酸重度降解，僅可成功擴增<br>DNA 100–200 bp、RNA < 80 bp；必須重建程序(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。

臨床重要性

分子病理檢體多以 FFPE 樣本為主，了解各固定液對核酸品質的影響，有助於選擇合適固定方式或預先通知實驗室選用衍生固定液（例如 alcoholic-based fixatives）以提高分子診斷成功率。