關於巢式聚合酶連鎖反應（ nested PCR ）的敘述，下列何者最不適當？

本題觀念：

巢式聚合酶連鎖反應（nested PCR）為增強PCR特異性及靈敏度而衍生之改良技術。此法分兩次PCR：第一次以 outer primers 放大包含目標序列之較長片段，第二次以 inner primers 於該片段內部再次放大，可降低非特異性擴增並提升檢測低量模板之成功率(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。

選項分析

• 選項A：將第一次PCR反應的產物作為第二次PCR反應的模板。
  正確，nested PCR 即以第一次擴增產物為第二次反應之起始模板，確保第二次僅放大首輪擴增到之序列(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。

• 選項B：需設計兩組引子（primers）。
  正確，nested PCR 需一對外部引子（outer primers）和一對內部引子（inner primers），合計兩組以完成兩輪反應(pcrtechbio.com)。

• 選項C：通常在模板 DNA 含量較高時使用。
  錯誤，nested PCR 主要應用於初始模板量極低或樣本雜訊高之情境，以提升靈敏度及特異性，若模板量充足則通常採用一般 PCR 即可(walshmedicalmedia.com)。

• 選項D：所使用的第二組引子（primer）會結合在第一次PCR產物的內部。
  正確，inner primers 專為第一輪產物內部序列設計，以確保僅目標片段能被二次擴增(pcrtechbio.com)。

答案解析

nested PCR 藉由兩組不同位置的引子對相同目標序列進行雙輪放大，第二輪內部引子僅能與首輪產物之內部序列結合，若第一次產物為非特異性副產物，第二組引子失去結合位點即可避免放大。因此此技術適用於模板量極低或背景 DNA 干擾嚴重之情況，並非在 DNA 含量高時才使用；相反，若模板充足則不需額外輪次而多用標準 PCR。選項C描述與 nested PCR 的臨床及實驗室應用目的相違，最不適當。

核心知識點

• nested PCR 原理：兩輪 PCR、兩對引子（outer vs. inner）、內部引子對於提升特異性之機制
• 適應症：low copy number 或 high background DNA 之樣本
• 技術優勢：提升 sensitivity 與 specificity
• 常見應用：低量病原體檢測、罕見基因突變分析

臨床重要性

nested PCR 在感染疾病診斷、法醫科學與分子遺傳研究中廣泛應用，能檢出一般 PCR 無法放大的微量目標序列；但因需開管轉移，易有污染風險，臨床實驗室須嚴格執行污染控制措施。