序列特異聚合酶連鎖反應（ polymerase chain reaction -seguence -specific primers, PCR -SSP）是基於sequence -specific primers 進行多樣性基因分型，下列敘述何者最不適當？

本題觀念：

序列特異引子聚合酶連鎖反應（PCR-SSP）利用3′端完全互補的引子才能有效延伸，當引子3′端對基因座的等位基因有單一鹼基不匹配時，因引子延伸效率極低而無法放大。此特性使PCR-SSP能快速且高特異性地分型多樣性基因，臨床最常用於HLA typing等領域。

選項分析

• 選項A
  臨床上確實可用在HLA typing，早期即有多篇研究利用PCR-SSP快速準確地對HLA-DR、HLA-B、HLA-C等位基因進行分型，適用於腎臟或造血幹細胞移植配對等場合，操作時間僅需數小時，準確度與血清學方法相當甚至更佳 (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。

• 選項B
  PCR-SSP 特異性建立於引子3′端與目標序列若存在不匹配，Taq polymerase就無法延伸而阻斷放大。Taq DNA polymerase正因缺乏3′→5′ exonuclease（proofreading）活性，才不會修復此類不匹配，才能保證等位基因的鑑別；故不需要且不能有3′→5′ exonuclease活性 (creative-biolabs.com)。

• 選項C
  操作時為避免偽陰性（如PCR失敗或樣本品質不佳），會同時設計一組針對保守序列的內生性對照引子，成功放大此內控片段即可證明PCR反應條件正常，因此內控組為必備 (bmcresnotes.biomedcentral.com)。

• 選項D
  傳統PCR-SSP反應後僅能依有無產物判別等位基因，最常用的檢測方式為琼脂糖膠電泳，藉由該產物帶判讀放大結果；即使後來有熒光探針法，可跳過電泳，但多數臨床與研究實驗室仍採用電泳分析 (creative-biolabs.com)。

答案解析

選項B最不適當。PCR-SSP的核心在於引子3′端不匹配抗拒放大，因此須使用不具3′→5′ exonuclease活性的Taq DNA polymerase，以確保單一鹼基錯配能阻斷非目標等位基因的放大，維持高度特異性。若具proofreading活性，錯配將被修正而失去鑑別能力，整個測試將失效。

核心知識點

• PCR-SSP原理：3′端完全配對才能延伸，利用單鹼基不匹配阻斷非目標放大
• 引子設計：每條等位基因至少一對特異性引子，3′末端需與目標序列相符
• Taq DNA polymerase：缺乏3′→5′ exonuclease活性，才能保證單鹼基不匹配導致放大失敗
• 內生性對照：防止偽陰性，驗證PCR反應成功
• 檢測方法：琼脂糖膠電泳（或熒光探針）
• 主要應用：HLA分型、藥物過敏基因型檢測（如HLA-B*15:02）、器官移植配對

臨床重要性

精準HLA分型可降低移植排斥反應、提升器官配對成功率；透過PCR-SSP快速分型，能在有限時間內完成捐贈者與受贈者的配對，對急性器官移植與藥物過敏安全監測具有重大意義。