下列何種等位基因特異性檢驗方法，需要在基因放大且經限制酶切割後，再進行膠體電泳分析？

本題觀念：

本題在考察各種等位基因特異性檢測（allele-specific detection）方法的原理差異，尤其聚焦於哪些技術步驟包含了基因擴增（PCR）、限制酶切割（restriction enzyme digestion）以及膠體電泳分析（gel electrophoresis）。

選項分析

• 選項A：amplification refractory mutation system（ARMS）
  ARMS-PCR 亦稱 allele-specific PCR，透過在引子3′端設計與野生型或突變型專一結合的末端鹼基，使只有完全配對的引子能進行擴增；診斷步驟與擴增步驟合併，無需後續限制酶切割。擴增後直接進行膠電泳即可判讀特異性產物 (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。因此不符合需「酶切後再膠電泳」的描述。

• 選項B：mutagenically separated PCR（MS-PCR）
  MS-PCR 為一管多重檢測，採用一組不同長度的等位基因專一引子，同時擴增野生型與突變型片段；僅憑 PCR 產物長度差異進行電泳分辨，無需酶切 (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。故亦不符合題意。

• 選項C：chemical cleavage of mismatch duplexes（CCM）
  CCM 先經 PCR 擴增，形成異源雙股體（heteroduplex），再用化學試劑（如 hydroxylamine、KMnO₄）修飾不配對鹼基，隨後以 piperidine 裂解，最後藉由電泳分析不同長度片段以定位突變點 (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。此方法雖有「裂解、電泳」，但所用為化學裂解，而非限制酶切割，與題目「經限制酶切割」不符。

• 選項D：amplified created restriction sites（ACRS）
  ACRS 又稱 created restriction-site PCR，設計一個在特定位點故意製造/破壞限制酶辨識序列的引子，PCR 擴增後針對該切割位點進行限制酶切割，最後以膠體電泳比較切割與未切割產物的大小差異，以鑑別等位基因 (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。步驟完整包含「PCR → 限制酶切割 → 膠電泳」，正符合題意。

答案解析

ACRS（amplified created restriction sites）在引子設計時加入額外不匹配鹼基，使得擴增後的 PCR 片段僅於特定等位基因呈現某一限制酶位點；隨後對該片段執行限制酶切割，最後藉由膠體電泳鑑別是否切割，分辨野生與突變等位基因。題目要求「需要在基因放大且經限制酶切割後，再進行膠體電泳分析」，唯 D 項 ACRS 符合完整程序。

核心知識點

• 等位基因檢測技術原理
  • Allele-specific PCR (ARMS)：3′端專一引子，無需酶切，直接膠電泳判讀 (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
  • Mutagenically separated PCR (MS-PCR)：一管雙或多個引子，不同長度，無需酶切，電泳鑑別 (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
  • Chemical cleavage of mismatch (CCM/CMC)：異源雙股體化學裂解，piperidine 裂解後膠電泳 (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
  • Amplified created restriction sites (ACRS/CRS-PCR)：引子製造或破壞限制酶位點 → 切割 → 膠電泳 (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
• PCR-RFLP、CAPS、dCAPS 相關原理比較
  • CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)：利用天然變異造成/消除限制酶位點，PCR 後酶切、膠電泳 (ncbi.nlm.nih.gov)
  • dCAPS (Derived CAPS)：引子設計引入不匹配以製造限制位點，PCR-RFLP 原理，與 ACRS 類似 (ncbi.nlm.nih.gov)

考生應熟悉每種技術的關鍵步驟與試劑：ARMS 與 MS-PCR 強調引子末端鹼基特異性；CCM 依賴化學試劑裂解異源雙股體；ACRS/CAPS/dCAPS 則倚重限制酶切割及後續膠電泳分子量分析。

臨床重要性

等位基因特異性檢測應用廣泛，包括藥物基因體學（如 CYP450 多型性）、癌症基因突變（如 BRAF V600E）、遺傳疾病（如 thalassemia）等；選擇合適方法可兼顧敏感度、特異度與檢驗實務操作成本。