111年:(醫檢)檢驗(1)
檢測血漿中巨大細胞病毒試驗,若發生非專一性 PCR 產物時,下列何項敘述最不適合用於改善該檢測方法?
A重新設計引子
B重新調整擴增條件
C使用 3'-->5' exonuclease 活性的 DNA 聚合酶
D使用熱啟動( hot-start ) DNA 聚合酶
詳細解析
本題觀念:
本題主要考察PCR反應中「特異性」(specificity)與「非專一性產物」(non-specific products)之改善方法。包括引子(primer)設計、擴增條件(退火溫度、Mg²⁺濃度、cycle參數)以及聚合酶(polymerase)特性的選擇,如是否具備3'→5'校對(proofreading)活性或熱啟動(hot-start)機制,對提高目的片段擴增的專一性及減少非目標擴增的影響。
選項分析
- 選項A 重新設計引子
良好的引子設計為提升PCR專一性的首要步驟。可透過延長引子長度至18–24nt、GC含量維持40–60%、避免自互補與引子二聚體(inter-primer complementarity)、並將G/C富集於3'端以強化特異性結合,均可減少mis-priming事件。(biotechrabbit.com) - 選項B 重新調整擴增條件
包含:- 調整退火溫度:提高退火溫度可加強正確配對的選擇性;
- 優化Mg²⁺濃度:Mg²⁺過高會降低專一性,通常在1–4mM間
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