關於PCR、RT-PCR及nested PCR 的敘述，下列何者最不適當？

本題觀念：

本題主要測驗考生對於三種常見分子生物技術：PCR（聚合酶連鎖反應）、RT-PCR（反轉錄聚合酶連鎖反應） 及 Nested PCR（巢式聚合酶連鎖反應） 之原理、步驟及應用差異的理解。特別是針對「反應階段」與「模板種類」的區分。

選項分析

• A. RT-PCR和PCR的主要差異是所使用的模板分別是RNA與DNA：適當。

  • PCR 的起始模板是 DNA。
  • RT-PCR (Reverse Transcription PCR) 的起始模板是 RNA。RNA 需先經過反轉錄酶 (Reverse Transcriptase) 作用轉錄為 cDNA (互補 DNA)，再以此 cDNA 為模板進行 PCR 擴增。因此，兩者最根本的差異確實是起始模板的種類。

• B. 巢式聚合酶連鎖反應（nested PCR）和RT-PCR都是經過兩階段的PCR反應：不適當（最不適當的選項）。

  • Nested PCR：確實包含兩階段的 PCR 反應。第一階段使用外側引物 (outer primers) 進行擴增，第二階段取第一階段的產物為模板，使用內側引物 (inner/nested primers) 再次進行 PCR 擴增。這兩階段都是標準的「PCR 循環反應」。
  • RT-PCR：雖然過程分為兩步（反轉錄 + PCR），但第一步是「反轉錄反應 (Reverse Transcription)」，這是一個由反轉錄酶催化的酶促反應，並非 PCR 擴增循環；只有第二步才是「PCR 反應」。因此，RT-PCR 是「一階段 RT + 一階段 PCR」，而非「兩階段 PCR」。
  • 這是在分子診斷考試中常見的觀念陷阱。

• C. 在RT-PCR反應中可以設計加入螢光物質或螢光探針（ probe），利用螢光訊號的偵測來判斷結果：適當。

  • 這裡的 RT-PCR 廣義上可包含 Real-time RT-PCR (RT-qPCR)。在臨床檢驗（如 COVID-19 檢測、病毒量測定）中，常在 RT-PCR 體系中加入螢光探針（如 TaqMan probe）或螢光染劑（如 SYBR Green），以即時監測產物量。即便是在傳統 RT-PCR 中，雖然較少見，但技術上亦可結合螢光標定引物。此敘述描述了現代臨床主流的檢測方式。

• D. 這三種技術都可以使用瓊脂凝膠電泳分析結果：適當。

  • PCR 與 Nested PCR 的產物都是 DNA 片段，標準分析方法即為瓊脂凝膠電泳 (Agarose Gel Electrophoresis)。
  • RT-PCR (傳統 End-point) 的產物也是 cDNA 擴增後的 DNA 片段，同樣使用電泳分析。
  • 即便是 Real-time PCR，其產物理論上也可以跑膠分析（雖然實務上直接看擴增曲線，但「可以使用」這點在技術上是成立的）。

答案解析

選項 (B) 最不適當。 Nested PCR 的核心特徵是進行「兩輪 PCR (Two rounds of PCR)」，利用兩對引物提高特異性與靈敏度。 RT-PCR 的核心特徵是先進行「反轉錄 (RT)」將 RNA 轉為 cDNA，再進行「一輪 PCR」。反轉錄過程不屬於 PCR 反應（沒有熱循環擴增）。將 RT-PCR 描述為經過「兩階段 PCR 反應」在原理上是錯誤的。

核心知識點

考生應釐清以下技術的定義與步驟：

1. RT-PCR (Reverse Transcription PCR)：
   • 模板：RNA。
   • 步驟：Step 1 反轉錄 (RT) $\rightarrow$ Step 2 PCR 擴增。
   • 注意：區分 Real-time PCR (qPCR) 與 Reverse Transcription PCR (RT-PCR)，但在臨床病毒檢驗中常結合為 Real-time RT-PCR。
2. Nested PCR (巢式 PCR)：
   • 目的：增加特異性 (Specificity) 與靈敏度 (Sensitivity)。
   • 步驟：兩輪 PCR。第一輪用外引物，第二輪用內引物（巢式引物）。
3. Real-Time PCR (qPCR)：
   • 特點：加入螢光探針/染劑，可「定量」，無需跑膠 (但在技術原理上產物仍是 DNA)。

參考資料

1. Nested PCR - 農業知識入口網
2. Nested Polymerase Chain Reaction (PCR) - PubMed
3. RT-PCR vs Nested PCR - AAT Bioquest