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115年:(醫檢)檢驗(1)

進行基因表現微陣列晶片（ gene expression microarray ）之數據分析，各樣本所有基因點的原始訊號分布如圖所示。則比較各樣本間之基因相對表現量前，應先進行下列何種處理最適當？ 圖片

A正常化／標準化（ normalization ）
B去除各樣本的極端值，減少差異
C以Student's t-test 對基因在各樣本間進行顯著差異分析
D忽略訊號變異最大的第 3樣本後，再進行分析

詳細解析

本題觀念：

基因微陣列數據分析流程 (Microarray Data Analysis Workflow)

微陣列實驗（Microarray）產生的高通量數據常伴隨非生物性的系統誤差（Systematic variation），例如：染劑標定效率不同、掃描儀器設定差異、雜合反應條件波動等。這些技術性誤差會導致不同樣本間的整體訊號強度分布不一致。為了確保不同樣本間的基因表現量具有可比性，在進行任何差異分析（如 Fold change 或 t-test）之前，必須先進行數據的正常化（Normalization）。

影像分析：

題目提供的圖片是一個箱型圖（Box plot），顯示了四個樣本（樣本1至樣本4）的原始訊號強度分布情況：

  1. 樣本間差異顯著：四個樣本的訊號分布位置（中位數）和分散程度（四分位距）皆有明顯差異。
    • 樣本4：整體訊號強度最強（中位數約18），遠高於其他樣本。
    • 樣本3：整體訊號強度最弱（中位數約8），且變異範圍（Range）最大。
    • 樣本1與2：介於中間，但彼此間仍有位移。
  2. 臨床意義：這種分布差異通常反映了技術性誤差（Technical variation）。若不經處理直接比較，樣本4中的任何基因看起來都會比樣本1或3中的同一個基因「表現量更高」，但这純粹是因為樣本4的整體背景訊號較強，而非生物學上的真實差異。

選項分析：

  • A. 正常化／標準化（normalization）：正確。

    • 理由：正常化的主要目的就是修正上述的系統性誤差，將不同樣本的訊號分布調整到相同的基準（例如將所有樣本的中位數對齊，或使分佈型態一致）。常見方法包括 Quantile Normalization、LOWESS 等。只有在正常化後，樣本間的基因表現量差異才代表真實的生物學意義。

  • B. 去除各樣本的極端值，減少差異：錯誤。

    • 理由：雖然去除極端值（Outlier removal）是品質控制（QC）的一部分，但它無法解決樣本間整體訊號強度（Mean/Median）不一致的問題。單純去除極端值無法將樣本4的整體高訊號拉回至與其他樣本可比較的水平。

  • C. 以 Student's t-test 對基因在各樣本間進行顯著差異分析：錯誤。

    • 理由：統計檢定（如 t-test）是用來尋找組間差異的工具，必須建立在「數據已具可比性」的基礎上。若使用未經正常化的原始數據（Raw data）進行檢定，系統誤差（如樣本4整體過亮）會導致產生大量的偽陽性（False positives），分析結果無效。

  • D. 忽略訊號變異最大的第 3樣本後，再進行分析：錯誤。

    • 理由：
      1. 變異大不代表樣本一定損壞，可能只是該樣本的背景值波動較大，這通常可以透過正常化修正。
      2. 即使移除了樣本3，樣本1、2、4之間的分布仍然不一致（例如樣本4仍遠高於樣本1），問題並未解決，仍然需要進行正常化。除非QC指標確認樣本3品質嚴重低落（如RNA降解），否則不應隨意剔除數據。

答案解析

圖中顯示原始數據在不同樣本間存在明顯的系統性偏差（Systematic bias），導致訊號分布不一。為了比較各樣本間的「相對表現量」，最優先且適當的處理步驟是正常化（Normalization），將各樣本的訊號強度校正至同一水平，消除技術誤差。

因此，正確答案是 (A)。

核心知識點

  1. 微陣列分析標準流程：影像掃描 →\rightarrow 訊號萃取 →\rightarrow 品質控制 (QC) →\rightarrow 正常化 (Normalization) →\rightarrow 差異表現分析 (Differential Expression Analysis)。
  2. 正常化目的：移除實驗操作過程中的非生物性變異（Non-biological variation），使樣本具備可比性。
  3. 箱型圖判讀：正常化前，各樣本箱型圖的中位數與寬度通常不齊；正常化後，各樣本的箱型圖應呈現水平對齊（中位數一致）。

參考資料

  1. Nucleic Acids Research, "Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation".
  2. Bioconductor Analysis Workflow regarding Microarray Preprocessing (RMA, MAS5).
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