ExamWise
115年:(醫檢)檢驗(1)

下列何種方法最不適合用於檢測遺傳疾病基因之點突變？

Apolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP ）
Bprobe hybridization
CSanger sequencing
Dreverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）

詳細解析

本題觀念：

本題主要測驗考生對於「遺傳疾病點突變（Point Mutation）」檢測方法的原理與限制的理解。核心觀念在於區分**基因型檢測（Genotyping，針對 DNA）與基因表現分析（Expression analysis，針對 RNA）**的差異。遺傳疾病通常源自於生殖細胞（Germline）的 DNA 變異，因此理論上全身細胞的 DNA 皆帶有此突變，適合直接檢測 DNA。

選項分析

  • A. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)：

    • 適合。這是檢測已知點突變的經典且常用方法。
    • 原理：先利用 PCR 擴增含有突變位點的 DNA 片段，再使用特定的限制酶（Restriction Enzyme）進行切割。如果點突變的存在導致了限制酶切位（Restriction site）的產生或消失，電泳後的片段長度就會與野生型不同（RFLP），藉此判斷有無突變。

  • B. Probe hybridization：

    • 適合。這類方法包含對偶基因特異性寡核苷酸探針（Allele-Specific Oligonucleotide, ASO）雜合反應、Dot blot 或 Reverse dot blot。
    • 原理：利用設計好的短片段 DNA 探針，在嚴格的雜合條件下，探針只會與完全互補的序列結合。單一個鹼基的點突變（Mismatch）會破壞雜合的穩定性，使探針無法結合，藉此區分野生型與突變型。常用於篩檢已知的特定突變。

  • C. Sanger sequencing：

    • 適合。這是檢測點突變的黃金標準（Gold Standard）。
    • 原理：直接對 PCR 擴增後的 DNA 片段進行定序，可以精確讀出每一個鹼基的序列。無論是已知或未知的點突變，Sanger 定序都能準確檢測出來。

  • D. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)：

    • 最不適合。RT-PCR 是將 RNA 反轉錄為 cDNA 後再進行 PCR 擴增，主要用於偵測**基因表現量（mRNA level）**或 RNA 病毒。
    • 理由：
      1. 組織特異性（Tissue Specificity）：遺傳疾病的致病基因可能只在特定組織（如腦、肝、肌肉）表現，而在一般抽血取得的白血球中可能不轉錄（不產生 mRNA）。如果該基因在血液細胞中不表現，就無法提取到 mRNA 進行 RT-PCR，導致無法檢測。
      2. 無義突變依賴性降解（NMD）：某些點突變（如 Nonsense mutation）會產生提早終止密碼子（Premature stop codon），導致細胞啟動 NMD 機制將異常的 mRNA 降解。這會使得突變的 mRNA 偵測不到，造成偽陰性或僅能測到野生型。
      3. 無法檢測未表現區域：RT-PCR 只能檢測外顯子（Exon）序列，若點突變位於啟動子（Promoter）或內含子（Intron）且未影響剪接，則無法透過分析 mRNA 發現。
      4. 檢體穩定性：RNA 較 DNA 不穩定，容易降解，處理上較困難。 雖然 RT-PCR 可用於檢測因突變導致的異常剪接（Splicing error），但作為「檢測點突變」的通用篩檢工具，其限制最多，故為最不適合的選項。

答案解析

答案為 (D) reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）。 遺傳疾病檢測的首選檢體通常是周邊血液中的白血球 DNA。選項 A、B、C 皆是直接針對 DNA 序列進行分析的成熟技術，適合檢測生殖細胞遺傳下來的點突變。選項 D (RT-PCR) 需要依賴 mRNA 的存在，受限於基因是否在採樣組織中表現（Expression）以及 mRNA 是否因突變而被降解（NMD），因此最不適合直接用於遺傳疾病點突變的常規診斷。

核心知識點

  1. 遺傳診斷首選檢體：周邊血白血球 DNA（Germline DNA is constant in all cells）。
  2. 點突變偵測方法：
    • PCR-RFLP：利用限制酶切位改變（適合已知突變）。
    • ASO Hybridization：利用探針專一性結合（適合已知突變）。
    • Sanger Sequencing：直接讀序（黃金標準，適合已知與未知突變）。
    • ARMS-PCR / AS-PCR：利用引物 3' 端錯配特異性擴增。
    • Real-time PCR (Melting curve / TaqMan)：利用螢光探針或熔點分析。
  3. RT-PCR 限制：
    • 依賴轉錄（Transcription-dependent）：需基因有表現才測得到。
    • NMD 效應：無義突變可能導致 mRNA 消失。
    • 只能看 cDNA（外顯子）：遺漏非編碼區突變。

參考資料

  1. Molecular Diagnostics: Techniques and Applications. Clinical Chemistry.
  2. Pitfalls of Quantitative Real-Time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction, Bustin SA, Journal of Biomolecular Techniques.
  3. Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) mechanisms and clinical implications.
了解本站架構