關於增幅阻礙突變系統（ amplification refractory mutation system, ARMS ）的敘述，下列何者最不適當？

本題觀念：

增幅阻礙突變系統 (Amplification Refractory Mutation System, ARMS)，又稱為等位基因特異性 PCR (Allele-Specific PCR, AS-PCR)，是一種利用 PCR 引子 3' 端與模板序列的配對特異性來檢測已知點突變或小片段缺失的分子檢驗技術。其核心原理在於：當引子 3' 端鹼基與模板 DNA 完全互補時，Taq 聚合酶可以進行延伸反應（增幅）；若 3' 端發生錯配 (mismatch)，則延伸反應受阻（阻礙），從而區分野生型與突變型。

選項分析

• A. 可偵測任何單一核苷酸點突變（point mutation）

  • 正確（此敘述適當）。ARMS 是偵測單一核苷酸多型性 (SNP) 或點突變的黃金標準方法之一。只要突變位點已知，即可針對該位點設計 3' 端互補或錯配的引子來進行區分。

• B. 可偵測小基因片段的剔除突變（ small deletion mutation ）

  • 正確（此敘述適當）。除了點突變外，ARMS 也能用於偵測小片段缺失或插入。設計引子時，可將 3' 端設計在缺失片段的接合處 (junction) 或缺失序列內部，使其僅在特定的突變型或野生型模板上延伸，達到檢測目的。

• C. 這檢驗方法侷限於已知突變的偵測

  • 正確（此敘述適當）。ARMS 需要針對特定的突變位點設計引子（3' 端必須對應到該突變鹼基），因此必須預先知道突變序列才能進行設計。它無法像定序 (Sequencing) 或高解析度熔解曲線 (HRM) 那樣用於篩檢未知的突變。

• D. 需要設計具有限制酶位點序列的引子

  • 錯誤（此敘述最不適當）。這是 PCR-RFLP（限制片段長度多型性）或 ACRS (Amplification Created Restriction Site) / dCAPS 的特徵。
  • ARMS 的原理是依靠引子 3' 端的錯配來阻斷 PCR 延伸，不需要限制酶切割，也不需要在引子中設計限制酶切位。
  • 雖然有時為了增加 ARMS 引子的特異性，會在 3' 端附近引入一個額外的人為錯配 (deliberate mismatch)，但这与引入「限制酶位點」完全不同。

答案解析

答案：D 選項 D 描述的是利用引子引入突變以創造限制酶切位的方法（通常稱為 mutagenic primer PCR-RFLP 或 ACRS），這不是 ARMS 的核心機制。ARMS 的檢測結果是直接觀察「有無 PCR 產物」來判斷基因型，完全不依賴限制酶消化。

核心知識點

1. ARMS-PCR 原理：利用 Taq DNA Polymerase 缺乏 3'→5' 外切酶活性 (Proofreading activity) 的特性。若引子 3' 端與模板錯配，聚合酶無法修復也難以延伸，導致 PCR 反應受阻。
2. 應用範圍：已知突變的基因分型 (Genotyping)，如地中海貧血 (Thalassemia)、囊腫纖維化 (CFTR) 等遺傳疾病及癌症 somatic mutation (如 EGFR, KRAS)。
3. 比較：
   • ARMS/AS-PCR：靠 3' 端特異性，直接看有無產物（或用不同長度產物區分）。
   • PCR-RFLP：擴增後用限制酶切，看片段長度。
   • Sanger Sequencing：黃金標準，可測未知突變。

參考資料

1. Newton CR, et al. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 1989;17(7):2503-16.
2. Little S. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current Protocols in Human Genetics. 1995.
3. Thermo Fisher Scientific. PCR Primer Design Tips - Behind the Bench.