於高效液相層析法中，有關檢品衍生化之敘述，下列何者錯誤？

本題觀念：

本題考查 高效液相層析法 (HPLC) 中 衍生化技術 (Derivatization) 的觀念，特別是 柱前衍生化 (Pre-column derivatization) 與 柱後衍生化 (Post-column derivatization) 的特性比較。

衍生化技術主要用於將無法直接被偵測（如無紫外光吸收、無螢光）或層析分離效果不佳的分析物，透過化學反應轉化為可偵測或易分離的衍生物。

選項分析

• A. 柱前（pre-column）衍生化可容許的反應時間比柱後（post-column）長

  • 正確。
  • 柱前衍生化通常是在樣品注入色譜柱之前進行（可為離線或在線），反應在瓶中或反應環中靜態進行，因此不受層析流速限制，可以容許較長的反應時間（數分鐘至數小時）以確保反應完全。
  • 柱後衍生化是在分析物離開色譜柱後，於反應管（Reaction coil）中與試劑混合反應。為了避免層析峰變寬（Band broadening）導致解析度下降，反應必須在流動狀態下極短時間內完成（通常限制在幾分鐘內）。因此，柱前的反應時間彈性遠大於柱後。

• B. 柱後（post-column）衍生化易受樣品中污染物的影響

  • 錯誤。
  • 柱後衍生化的最大優勢之一是分離在反應之前。樣品中的基質干擾物（污染物）通常已經在色譜柱中與目標分析物分離開來。當試劑加入時，干擾物可能已經流出或尚未流出，因此不會與分析物同時反應並干擾檢測。
  • 相反地，柱前衍生化是將整個樣品基質與試劑反應，樣品中的雜質也會發生衍生化反應，產生大量的副產物峰，這些副產物往往會干擾目標分析物的層析分離，造成背景雜訊高，使色譜圖變得複雜。因此，柱前衍生化才較易受樣品中污染物影響。

• C. 在柱後（post-column）衍生化中，如生成多種衍生物亦不影響檢品之定性分析

  • 正確。
  • 在柱後衍生化中，分析物已經先經過色譜柱分離。即使在柱後反應器中，一個分析物與試劑反應生成了多種衍生物（例如產物 A 和產物 B），由於反應後直接進入偵測器，且這段管路很短，這些產物會同時到達偵測器，表現為單一個色譜峰。該峰的滯留時間（Retention time）是由未衍生化的原始分析物在柱內的行為決定的。因此，生成多種產物不會導致峰的分裂，不影響定性。
  • 反之，若是柱前衍生化，生成多種衍生物會導致在色譜柱中分離出多個峰，造成定性定量困難。

• D. 將鏡像異構物衍生化成非鏡像異構物後，可使用無光學活性的層析管柱分析

  • 正確。
  • 這是層析法分離鏡像異構物（Enantiomers）的常用策略之一（間接法）。鏡像異構物的物理化學性質在非手性環境下相同，難以分離。但若與具光學活性的衍生化試劑（Chiral reagent）反應，會生成非鏡像異構物（Diastereomers）。非鏡像異構物具有不同的物理性質（如極性、溶解度），因此可以使用一般的非手性（無光學活性）層析管柱（如 C18 柱）將其分離。

答案解析

選項 (B) 敘述錯誤。柱後衍生化因「先分離、後反應」的特性，分析物已與基質雜質分開，故相較於柱前衍生化，其更不易受樣品中污染物的干擾。

核心知識點

1. 柱前衍生化 (Pre-column)：
   • 優點：反應時間無限制、試劑選擇多、設備簡單（可離線進行）、可提升分離度（若衍生物性質較好）。
   • 缺點：反應產物需穩定、基質干擾大（雜質也會反應）、若生成多種衍生物會產生多峰干擾。
2. 柱後衍生化 (Post-column)：
   • 優點：自動化程度高、重現性佳、基質干擾少（因已先分離）、不需要反應完全（只要重現即可）、生成多種產物不影響峰形。
   • 缺點：設備昂貴複雜（需額外幫浦與反應器）、受反應動力學限制（需快速反應）、**造成峰變寬（Band broadening）**降低解析度。
3. 手性分離策略：
   • 直接法：使用手性固定相（Chiral column）或移動相中加入手性添加劑。
   • 間接法：使用手性衍生試劑生成非鏡像異構物，再用一般管柱分離。

參考資料

1. HPLC 衍生化技術比較 - Antpedia
2. Post-column Derivatization in HPLC - Principles and Applications
3. Skoog, D. A., et al. "Principles of Instrumental Analysis."