如果想要製作標記具有放射性之³²P 的基因片段探針（probe），通常會利用DNA 聚合酶（DNA polymerase）來合成此片段 ，進行該反應時需加入下列何種³²P-dATP 材料來進行標記？
詳細解析
本題觀念
製作放射性DNA探針（probe）時，是靠DNA聚合酶（DNA polymerase）以既有的引子（primer）為起點，把單顆去氧核苷三磷酸（dNTP，如dATP）逐一接到正在延長的DNA鏈上。每個dNTP分子帶有三個磷酸基，由內而外依序稱為α、β、γ磷酸。DNA聚合酶催化反應時，引子3'端的氫氧基（3'-OH）會親核攻擊入來dNTP最靠近核糖的α磷酸，形成新的磷酸雙酯鍵（phosphodiester bond），同時把β與γ磷酸以焦磷酸（pyrophosphate, PPi）的形式一起釋放出去。換句話說，只有α磷酸會真正被留下來、成為新合成DNA鏈骨架的一部分，β與γ磷酸則會離開反應產物。本題問的是要標記哪一個磷酸位置，放射性訊號才能跟著留在做出來的探針上。
選項分析
- A. α-³²P-dATP：α磷酸是DNA聚合酶反應中會被保留、併入新生DNA鏈的那一個磷酸，因此標記在α位置能讓放射性訊號真正留在合成出的探針分子上，是正確答案。
- B. β-³²P-dATP：β磷酸會隨焦磷酸副產物（連同γ磷酸）一起被釋出，並不會留在新合成的DNA鏈上，標記在此位置無法讓探針帶有放射性，故不適用。
- C. γ-³²P-dATP：γ磷酸同樣會隨焦磷酸副產物釋出而不會併入新合成的DNA鏈；帶γ磷酸放射性的核苷酸（如γ-³²P-ATP）常用於另一種標記法——T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase）進行的寡核苷酸5'端標記，但這不是DNA聚合酶合成反應所用的材料，故不適用於本題情境。
- D. ATP：ATP是含有2'-OH的核糖核苷酸（ribonucleotide），並不是DNA聚合酶所需的去氧核糖核苷酸（dNTP）受質；DNA聚合酶專一辨認dNTP，無法有效利用ATP來延長DNA鏈並完成標記，故不適用。
答案解析
本題答案為A。DNA聚合酶合成反應的化學本質，是引子3'-OH對入來dNTP的α磷酸進行親核攻擊，形成新的磷酸雙酯鍵，並把β、γ磷酸以焦磷酸形式整組釋放；這代表無論是哪一種dNTP，只有α磷酸位置的原子會真正留在新生成的DNA鏈中。因此若要用放射性同位素標記「經聚合酶合成、併入DNA鏈」的探針，一定要把³²P標記在α磷酸的位置，也就是α-³²P-dATP，訊號才會跟著探針一起保留下來；若標記在β或γ位置，放射性磷會隨焦磷酸離開反應系統，探針本身反而偵測不到訊號。這也是市售放射性標記試劑（如隨機引子法random priming、缺口轉譯nick translation）固定採用α-³²P-dNTP規格的原因。
核心知識點
複習這題要記住dNTP三個磷酸基（α、β、γ）在DNA聚合酶反應中的去留：α磷酸留下、併入DNA鏈；β與γ磷酸以焦磷酸形式一起離開。凡是「經聚合酶合成反應」標記的放射性探針，一律用α-³²P-dNTP；相對地，若是要標記已存在的寡核苷酸或RNA的5'端（末端標記，end-labeling），才會用到T4多核苷酸激酶搭配γ-³²P-ATP，兩種標記情境與磷酸位置千萬不要混淆。此外也要分清楚核糖核苷酸（ribonucleotide，如ATP）與去氧核糖核苷酸（dNTP，如dATP）的差異，DNA聚合酶只能利用後者作為受質，這是分子生物學實驗設計的基礎觀念。
參考資料
- Nucleic Acids Research: Pyrophosphate hydrolysis is an intrinsic and critical step of the DNA synthesis reaction. https://academic.oup.com/nar/article/46/12/5875/5017762
- Wikipedia: DNA polymerase. https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_polymerase
- Revvity (PerkinElmer) EasyTides: dATP, [α-32P]-. https://www.revvity.com/product/easytides-datp-a-32p-blu512z250uc
- Wikipedia: Nick translation. https://en.wikipedia.org/wiki/Nick_translation
- ScienceDirect Topics: Nick Translation. https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/nick-translation