有關流式細胞儀分析細胞免疫分型螢光訊號之敘述，下列何者正確？

本題觀念

流式細胞儀進行細胞免疫分型時，常以單株抗體結合不同螢光染劑（fluorochrome），再以特定波長雷射激發螢光後，由偵測器分別接收不同波峰的螢光訊號，進而判讀細胞表面標記的組合。臨床最常見的488 nm氬離子（或固態）雷射，能否同時有效激發多種螢光物質，以及不同螢光物質激發峰、發射峰與光譜重疊情形，直接決定多色染色設計是否可行、以及是否需要進行螢光補償校正。本題即在檢驗fluorescein（FITC）與phycoerythrin（PE）這兩種免疫分型最常用螢光染劑的物理特性是否正確。

選項分析

• A ✅ fluorescein（FITC）的激發峰約在488~495 nm，與488 nm雷射高度吻合；phycoerythrin（PE）具雙激發峰，主要峰約565 nm、次要峰約495 nm，在488 nm波長下仍有良好激發效率。因此單一488 nm雷射即可同時有效激發FITC與PE兩種螢光物質，此為臨床雙標或多標免疫分型染色設計的物理基礎，敘述正確，為本題答案。
• B ❌ fluorescein被488 nm雷射激發後之螢光發射波峰約在515~525 nm，屬綠光範圍，並非574 nm；574 nm左右其實是phycoerythrin的發射波峰，本選項將兩種螢光物質的發射波峰數值對調，敘述錯誤。
• C ❌ phycoerythrin被激發後之螢光發射波峰約在573~576 nm，屬橙黃光範圍，並非517 nm；517 nm左右其實是fluorescein的發射波峰，本選項同樣將兩者發射波峰數值對調，敘述錯誤。
• D ❌ FITC（發射峰約515~525 nm）與PE（發射峰約573~576 nm）雖然峰值位置不同，但兩者的螢光發射光譜實際上有明顯重疊，尤其FITC發射光譜的尾端會延伸進入PE偵測通道，造成訊號串色，敘述「不會重疊」與實際情形相反，錯誤。

答案解析

本題答案為A。fluorescein（FITC）與phycoerythrin（PE）是流式細胞儀免疫分型最經典的雙染組合，兩者的激發波長範圍恰好都涵蓋488 nm：FITC的激發峰本身就落在488~495 nm附近，效率最高；PE雖然主要激發峰在565 nm，但因具有雙激發峰特性，於495 nm附近亦有一個次要激發峰，使其在488 nm雷射照射下同樣能被有效激發並釋出橙黃色螢光。正因如此，單一488 nm雷射即可同時驅動FITC與PE兩種螢光染劑分別發光，再由不同偵測器（FL1接收綠光約515~525 nm、FL2接收橙黃光約573~576 nm）分別接收，達成雙色標記分析的目的。B、C兩選項則是把FITC與PE的發射波峰數值互相對調，明顯與實際光譜特性不符；D選項忽略了FITC發射光譜尾端會延伸進入PE偵測通道造成訊號串色（spillover）的事實，這也是多色流式分析必須以單染對照組進行螢光補償（compensation）校正的原因。

核心知識點

• FITC激發峰約488~495 nm，發射峰約515~525 nm（綠光），由FL1偵測器接收
• PE具雙激發峰（約495 nm、565 nm），發射峰約573~576 nm（橙黃光），由FL2偵測器接收
• 單一488 nm雷射可同時有效激發FITC與PE，是臨床雙色/多色免疫分型染色設計的物理基礎
• FITC與PE發射光譜有明顯重疊（尤其FITC尾端延伸入PE通道），需以單染對照組進行螢光補償校正串色
• 多色流式細胞術中FITC、PE、PerCP-Cy5.5等螢光物質皆可被488 nm雷射激發，再由各自偵測器分別接收

參考資料

• Fluorescein - Wikipedia
• Phycoerythrin - Wikipedia
• Flow Cytometry Fluorophores for the Blue Laser - Bio-Rad Antibodies
• Fluorescence Compensation in Flow Cytometry - Bio-Rad Antibodies
• FITC (Fluorescein Isothiocyanate) Application Note - AAT Bioquest