以基因定序法進行 16S rRNA 基因序列比對之結果，若要達到菌種（ species）層級之鑑定，下列何者錯誤？

本題觀念：

此題探討利用 16S rRNA 基因序列比對進行細菌鑑定時，對於菌種（species）層級的鑑定準則，包括序列相似度門檻、比對長度需求、比對參考庫選擇，以及相似度分差判讀等。

選項分析

• 選項A
  敘述「大於95%序列相似度，才可判定為同種（species）」。此數值實為屬（genus）判別常用的下限門檻，若要達到 species 層級，需更高的相似度（一般採用 ≥99%），因而本選項錯誤。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

• 選項B
  敘述「若序列比對結果最高及第二高相似菌種序列，彼此相似度的差異性小於0.5%，則應使用其他試驗進行菌種之確認」。符合 CLSI MM18 對 species 層級鑑定的解讀準則：需要最高相似度 ≥99%，且與次高相似度至少相差 0.5%，否則需輔以其他方法確認，故此選項正確。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

• 選項C
  敘述「以標準參考菌株比對為最佳」。CLSI 與多數實驗室慣用策略皆建議優先比對 type strain（標準參考株）序列，以確保鑑定準確性，故此選項正確。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

• 選項D
  敘述「可序列比對之基因長度，應至少 500 個核苷酸以上」。多個研究與 CLSI MM18 指南指出，16S rRNA 基因首段（V1–V3，約 500 bp）即可提供 genus 及 species 層級的鑑定資訊；若序列過短，容易因資訊不足導致偽陽性或偽陰性，故建議最少 500 bp 以上，選項正確。(clsi.org)

答案解析

根據 CLSI MM18-Ed2（2018年修訂版）Interpretive Criteria for Identification of Bacteria and Fungi by Targeted DNA Sequencing，對 16S rRNA 基因進行 species 層級鑑定時，需同時符合：（1）最高比對序列相似度 ≥99%；（2）與次高相似序列相差 ≥0.5%；（3）比對序列長度至少 ~500 bp；（4）以 type strain 參考序列庫為主。選項A 將 species 層級門檻錯誤標示為 95%，實為 genus 層級門檻，因此 A 為錯誤敘述。

核心知識點

• 16S rRNA 基因鑑定原理：保守區與可變區結合，序列長度愈長解析度愈高
• 鑑定層級相似度門檻：
  • Genus：≥95%
  • Species：≥99%（舊文獻亦用 97–98.7%，最新建議以 ≥99% 最可靠） (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
• 與次高相似序列差異需 ≥0.5%，差距不足時須輔以其他生化或分子檢驗 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)
• 序列長度需求：建議至少 500 bp（V1–V3）或全長 (>1,300 bp) 以提高鑑定信度 (clsi.org)
• 參考庫選擇：以 type strain（標準參考株）序列為首選，避免次級或無效命名序列干擾

臨床重要性

正確鑑定致病菌種有助於臨床抗生素選擇與感染來源追蹤，不當的相似度門檻或序列長度不足，都可能誤導診斷並延誤治療。