油滴數位化聚合酶連鎖反應（ droplet digital PCR, ddPCR ）是藉由單分子油滴式隔離進行核酸拷貝數的絕對定量；對檢測腫瘤微量突變等位比例（ mutation allele frequency, MAF ）有極高敏感度。圖示為利用ddPCR收取16,000顆油滴，進行 A基因野生型與突變型之螢光訊號強度的分析結果，超過閾值的油滴數目以紅字標示。此突變等位比例為何？

本題觀念：

本題主要在考察 droplet digital PCR（ddPCR）的絕對定量原理，以及如何計算 mutation allele frequency（MAF），也就是用 ddPCR 分別偵測到的突變型與野生型陽性油滴數之比。

影像分析：

從左側圖「A基因突變型特異檢測」可見，以紅色標示的高螢光強度（超過閾值）油滴數為 600；黑灰色點為陰性或雨滴（rain）區域油滴。右側圖「A基因野生型特異檢測」紅色標示的陽性油滴數為 4200，其餘為未偵測或陰性油滴。題目敘述共收集了 16000 顆油滴，代表左右兩個檢測分別對同一樣本進行突變型與野生型探針偵測，並統計各自的陽性油滴數。

選項分析

計算 MAF 時，公式為： 突變等位比例（%）= 突變型陽性油滴數 ÷ (突變型陽性 + 野生型陽性油滴數) × 100% (packages.oit.ncsu.edu)

各選項套用計算結果：

• 選項A：3.8%
  計算應為 600 ÷ (600 + 4200) ≈ 12.5%，與 3.8% 相差甚遠，排除。

• 選項B：14.3%
  若為 600 ÷ 4200 × 100% 則約為 14.3%，但此錯誤地將分母只取野生型油滴數，並非正確公式，排除。

• 選項C：12.5%
  正確計算 600 ÷ (600 + 4200) = 600 ÷ 4800 = 0.125，乘以 100% 得 12.5%，符合公式，為正確答案。

• 選項D：16.7%
  若為 600 ÷ 3600（假設分母取總油滴數減去陰性）則為 16.7%，此亦非本題公式，不符，排除。

答案解析

本題利用 ddPCR 絕對定量特色，將樣本分為若干微小油滴，分別進行突變型與野生型探針擴增並記錄陽性油滴數。依據 ddPCR 分析流程，突變等位比例的計算只需將突變型陽性滴數除以突變型加野生型陽性滴數總合，再乘以 100% 即可。題中數據帶入公式 600/(600+4200)×100%＝12.5%，因此正確答案為選項 C。

核心知識點

1. ddPCR 原理：樣本分散於大量油滴，每滴可視為單一反應體，經 PCR 後偵測螢光訊號，以辨別陽性滴（含目標序列）與陰性滴，達到絕對定量。
2. Poisson 分布校正：若滴內可能含多拷貝 DNA，需用 Poisson 分布進行拷貝數校正。
3. variant allele frequency（MAF）計算：
   • MAF (%) = 突變型陽性滴數 ÷ (突變型陽性滴數 + 野生型陽性滴數) × 100%。
4. 實驗操作：利用雙探針系統（wild-type probe 標記 HEX, mutant probe 標記 FAM）於 QX-200 droplet reader 讀取 10,000–18,000 顆油滴的螢光訊號，並在軟體中設定閾值區分各種族群油滴 (jmdjournal.org)。

臨床重要性

精準計算腫瘤組織或液體活檢中微量突變等位基因頻率，有助於早期偵測、治療反應監測及耐藥突變追蹤，對癌症個人化醫療具有關鍵價值。