以次世代定序（ next-generation sequencing, NGS ）技術進行腫瘤基因突變檢測時，擴增過程常造成定序錯誤；下列何種方式可以最有效降低定序錯誤率？
詳細解析
本題觀念：
本題考查的是次世代定序（NGS）在腫瘤基因檢測中的技術瓶頸與誤差修正機制。 在 NGS 建庫過程中，為了獲得足夠的 DNA 量上機定序，通常需要進行 PCR 擴增。然而，聚合酶在複製過程中可能會隨機引入錯誤（PCR errors），且定序儀器本身也有一定的錯誤率（Sequencing errors）。這些技術誤差（noise）通常在 0.1% ~ 1% 之間，會與腫瘤檢體中真實存在的低頻率體細胞突變（low-frequency somatic mutations）混淆，導致偽陽性（False Positive）。
選項分析
-
(A) 增加起始 DNA 量進行反應： 增加起始 DNA 量有助於提升樣本的複雜度（Library Complexity）和偵測靈敏度，能減少因取樣誤差導致的偽陰性，但無法「修正」或「區分」後續擴增過程中產生的聚合酶錯誤。若聚合酶出錯，錯誤仍會被保留。
-
(B) 提高樣本的腫瘤細胞含量： 這能提高突變等位基因頻率（Variant Allele Frequency, VAF），讓突變訊號更強，更容易被偵測到。雖然這相對降低了背景雜訊的干擾，但這屬於樣本前處理的範疇，並非技術上降低「定序錯誤率」的方法。
-
(C) 使用獨立分子索引（ unique molecular index, UMI ）作為條碼： 這是正確答案。
- 原理：UMI 是在 PCR 擴增 之前，連接到每個原始 DNA 片段上的短隨機核苷酸序列（通常為 6-12 bp）。
- 機制：每個原始 DNA 分子都有一個獨一無二的 "身分證" (Barcode)。經過 PCR 擴增後，所有來自同一個原始分子的拷貝（Clones）都會帶有相同的 UMI。
- 誤差修正 (Error Correction)：在生物資訊分析時，將帶有相同 UMI 的序列歸類為一組（Family）。
- 若某個突變位點出現在該組的 所有 序列中，代表這是原始 DNA 就有的真實突變。
- 若突變只出現在該組的 部分 序列中，代表這是 PCR 擴增或定序過程中產生的隨機錯誤（Random Error），應予以剔除。
- 效果：此技術可利用「共識序列（Consensus Sequence）」將定序錯誤率大幅降低（可低至 <0.01%），是目前檢測微量殘存疾病（MRD）或液態切片（Liquid Biopsy）中低頻突變的黃金標準。
-
(D) 增加文庫建構（library construction）時，聚合酶連鎖反應（PCR）的循環次數： 這會導致反效果。增加 PCR 循環次數會增加「PCR 偏差（PCR Bias）」和「PCR 重複（PCR Duplicates）」，且聚合酶隨機出錯的機會累積更多。若錯誤發生在早期循環（Jackpot mutations），該錯誤會被大量擴增，反而大幅增加偽陽性的風險。
答案解析
正確答案是 (C) 使用獨立分子索引（ unique molecular index, UMI ）作為條碼。 NGS 的擴增與定序錯誤是隨機發生的，透過 UMI 標記原始分子，可以進行生物資訊學上的「去重複（De-duplication）」與「糾錯（Error correction）」。透過比對同一 UMI 家族內的序列一致性，可以有效過濾掉擴增過程引入的隨機錯誤，是目前降低定序錯誤率最有效的技術手段。
核心知識點
- UMI (Unique Molecular Identifier/Index)：
- 功能：區分「PCR 重複（PCR duplicates）」與「真實生物學重複」。
- 應用：液態切片（ctDNA）、低頻率突變檢測（<1% VAF）、微量殘存疾病（MRD）。
- 原理：利用 Consensus Sequencing 建立共識序列，剔除隨機誤差。
- PCR Bias & Errors：PCR 循環數越多，偏差與錯誤累積越嚴重。高保真（High-fidelity）聚合酶與 UMI 是解決方案。
- 定序深度 (Sequencing Depth)：使用 UMI 需要極高的定序深度（超深定序），因為需要多個讀段（Reads）來構建一個共識序列。