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115年:(醫檢)檢驗(1)

關於光引導原位合成法（ light-directed synthesis ）之DNA晶片，下列敘述何者最正確？

ADNA晶片是將已經標定螢光的 DNA探針固定於矽晶片（ silicon）
B在合成DNA探針時，只能知道探針的序列，但無法設定探針在矽晶片上的位置
CDNA晶片上的探針長度大多介於20～25個核苷酸
DDNA晶片只能偵測基因變異，無法用來檢測基因表達量的差別

詳細解析

本題觀念：

本題考查的核心觀念是光微影製程（Photolithography）應用於DNA晶片（Microarray）的光引導原位合成法（Light-directed in situ synthesis）。

這項技術最著名的代表是 Affymetrix 公司的 GeneChip 系統。其原理是利用半導體製程中的光罩（Masks）或微鏡陣列（Micromirrors）技術，配合光敏感保護基（Photolabile protecting groups），在矽晶片或石英基板上「原位（in situ）」逐個核苷酸合成大量的DNA探針。

選項分析

  • A: DNA晶片是將已經標定螢光的 DNA探針固定於矽晶片（ silicon）

    • 錯誤。
    • 解析：
      1. 在光引導原位合成法中，探針是直接在晶片上合成的，並非「預先合成好再固定」。
      2. 標定對象錯誤：在微陣列實驗中，被標定螢光（或生物素）的是待測樣品（Target，如 cDNA 或 cRNA），而不是晶片上的探針（Probe）。晶片上的探針是已知序列的單股 DNA，負責抓取（雜交）樣品。

  • B: 在合成DNA探針時，只能知道探針的序列，但無法設定探針在矽晶片上的位置

    • 錯誤。
    • 解析：光引導合成法的核心優勢正是精確定位。透過光罩（Mask）或數位微鏡裝置（DMD）控制光線照射的位置，只有被光照射到的區域會去保護（deprotection），允許下一個核苷酸接合。因此，晶片上每一個座標點（Feature/Spot）的探針序列都是由設計者預先設定且精確已知的。

  • C: DNA晶片上的探針長度大多介於20～25個核苷酸

    • 正確。
    • 解析：採用光引導原位合成法（如 Affymetrix GeneChip）製造的晶片，受限於光化學反應的逐步產率（stepwise yield），探針長度通常較短。標準的 Affymetrix 探針長度為 25-mer（25個核苷酸）。
    • 比較：另一種常見的噴墨列印式（Inkjet）或點製式（Spotted）晶片，可能會使用較長的寡核苷酸（如 Agilent 的 60-mer）或更長的 cDNA 片段（500~2000 bp），但題目限定為「光引導原位合成」，故 20~25 nt 是最準確的描述。

  • D: DNA晶片只能偵測基因變異，無法用來檢測基因表達量的差別

    • 錯誤。
    • 解析：DNA 晶片（微陣列）最廣泛的應用之一就是基因表達譜分析（Gene Expression Profiling），透過偵測 mRNA 反轉錄後的 cDNA/cRNA 與探針雜交的螢光強度，來定量基因的表達高低。當然，它也可用於偵測單核苷酸多型性（SNP）或基因變異，但說「無法檢測表達量」是完全錯誤的。

答案解析

正確答案為 (C)。

光引導原位合成法（Light-directed synthesis）是製造高密度寡核苷酸晶片（High-density oligonucleotide array）的關鍵技術。由於化學合成效率的限制，此技術所合成的探針長度通常較短，標準規格約為 25個核苷酸（25-mer）。為了彌補短探針特異性可能不足的問題，這類晶片通常會針對每一個基因設計多組探針（Probe set，包含 Perfect Match 和 Mismatch）來進行綜合分析。

核心知識點

考生應比較並掌握兩種主要 DNA 微陣列技術的差異：

特性原位合成寡核苷酸晶片 (In-situ Synthesized Oligo Array)點製式 cDNA/寡核苷酸晶片 (Spotted Array)
代表技術Affymetrix (GeneChip)自製點片、Agilent (Inkjet)
製造原理光微影技術 (Photolithography) / 光引導原位合成機械手臂點樣 / 噴墨列印
探針長度短 (約 20-25 mer)長 (Oligo: 60 mer; cDNA: >500 bp)
探針密度極高 (High Density)中等
單/雙色通常為單色螢光 (Single-channel)，一片晶片跑一個樣品通常為雙色螢光 (Two-channel, Cy3/Cy5)，二個樣品競爭雜交
主要應用基因表達分析、SNP Genotyping、Resequencing基因表達分析、CGH
標定對象待測樣品 (Target)待測樣品 (Target)

參考資料

  1. Irizarry, R. A., et al. "Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data." Nucleic acids research 31.4 (2003): e15-e15. (Confirming 25-mer probe length)
  2. Lipshutz, R. J., et al. "High density synthetic oligonucleotide arrays." Nature genetics 21.1 (1999): 20-24. (Describing light-directed synthesis and advantages)
  3. Affymetrix GeneChip Technical Note. (Regarding probe design and photolithography process)
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