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115年:(醫檢)檢驗(1)

關於變性梯度膠體電泳法（ denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE ），下列敘述何者正確？

A隨著變性劑濃度增加， DNA開始解離形成單股，而增加移動速率
B欲分析之 DNA分子的Tm較低時，其解析力較佳
C欲決定出變性劑的最佳使用濃度範圍，宜使用電泳方向與變性劑梯度垂直的電泳方式
D電泳操作之溫度需隨變性劑濃度增加而增加

詳細解析

本題觀念：

本題考查 變性梯度膠體電泳法 (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 的核心原理與操作細節。DGGE 是一種利用 DNA 分子序列差異導致的 熔點 (Tm) 不同，在含有化學變性劑（如 Urea 和 Formamide）梯度的聚丙烯醯胺凝膠中進行分離的技術。

選項分析

  • A. 隨著變性劑濃度增加， DNA開始解離形成單股，而增加移動速率

    • 錯誤。
    • 解析：在 DGGE 中，雙股 DNA 在電泳過程中移動至特定變性劑濃度時，較低熔點的區域 (melting domain) 會先解離 (partially melt)，形成類似「分岔」或「泡狀」的立體結構 (branched structure)。這種結構會顯著增加 DNA 分子在膠體孔隙中移動的阻力，導致其移動速率 急遽下降 (retardation)，甚至停滯，而非增加速率。這正是 DGGE 能分離不同序列 DNA 的基礎。

  • B. 欲分析之 DNA分子的Tm較低時，其解析力較佳

    • 錯誤。
    • 解析：DGGE 的解析力主要取決於 DNA 片段的熔解行為 (melting behavior) 以及變性劑梯度的範圍設定是否適當，而非單純取決於 Tm 的高低。
    • 事實上，為了獲得最佳解析力，通常會人為加上一段高 GC 含量的序列 (GC-clamp)，確保目標序列成為較低熔點區域 (Low melting domain) 而先解離，防止雙股完全分開。若 Tm 過低或序列太短，可能會過早解離或無法形成穩定的部分解離態，反而不利分析。有些文獻甚至指出極高 GC 含量（高 Tm）的片段較難分析，但這並不代表低 Tm 就一定解析力佳，關鍵在於梯度範圍是否能精準涵蓋該片段的熔解區間。

  • C. 欲決定出變性劑的最佳使用濃度範圍，宜使用電泳方向與變性劑梯度垂直的電泳方式

    • 正確。
    • 解析：這是 DGGE 實驗建立標準流程的步驟。
      • 垂直 DGGE (Perpendicular DGGE)：樣品加在膠體上方一整條溝槽，電泳方向與變性劑梯度方向垂直 (Gradient 0% -> 100% 橫向分布)。電泳後，DNA 會呈現一條 S 型或斜線曲線 (Sigmoid curve)，由此曲線可觀察該 DNA 片段在何種變性劑濃度下開始熔解 (Retardation point)。這能幫助實驗者決定後續平行 DGGE 所需的「最佳變性劑濃度範圍」（例如：40% ~ 60%）。
      • 平行 DGGE (Parallel DGGE)：用於大量檢體篩檢，電泳方向與變性劑梯度方向平行。

  • D. 電泳操作之溫度需隨變性劑濃度增加而增加

    • 錯誤。
    • 解析：DGGE 的操作溫度通常是 恆定 的（一般設定在 60°C 左右）。
    • 變性梯度的形成是依賴膠體中預先灌製的 化學變性劑 (Urea 和 Formamide) 濃度 變化，而非溫度變化。
    • 利用溫度梯度來分離的技術稱為 TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis)，那是另一種技術。

答案解析

正確答案為 (C)。 垂直 DGGE (Perpendicular DGGE) 是專門用於分析單一 DNA 片段的熔解曲線 (Melting curve)，藉此決定該片段發生構型改變（部分熔解）時對應的變性劑濃度，進而設定正式實驗（平行 DGGE）時的最佳梯度範圍，以獲得最佳解析度。

核心知識點

  1. DGGE 原理：利用相同長度但序列不同的 DNA 片段，其 Tm 值不同，在化學變性劑梯度膠體中會在不同位置發生 部分熔解 (Partial Melting)。
  2. 移動速率變化：部分熔解後，DNA 構型改變（變大/分岔），導致電泳移動速率 變慢/停滯 (Retarded)。
  3. GC-Clamp (GC 鉗)：常在引物 (Primer) 5' 端加上一段 30-50 bp 的高 GC 序列，作為最高熔點區域，防止兩股 DNA 在電泳中完全分離 (Complete dissociation) 變成單股（單股跑得不穩定且快，無解析力）。
  4. 兩種電泳模式：
    • Perpendicular (垂直)：找條件（測量 Tm 行為）。
    • Parallel (平行)：跑檢體（多樣本突變篩檢）。
  5. 操作條件：恆溫 (60°C)、化學梯度 (Urea/Formamide)。

參考資料

  1. Bio-Rad DCode™ Universal Mutation Detection System Manual: Describes Perpendicular DGGE for determining optimal denaturant conditions and Parallel DGGE for mutation screening.
  2. Myers, R. M., et al. (1987). "Detection of single base substitutions by ribonuclease cleavage at mismatches in RNA:DNA duplexes." (Foundational paper principles).
  3. National Center for Biotechnology Information (NCBI) - PubMed Bookshelf: Principles of DGGE and TGGE.
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