115年:(醫檢)檢驗(1)
關於次世代定序及傳統桑格定序的方法之敘述，下列何者最正確？
A兩者皆需建立文庫（ library）
B就單一片段而言，桑格定序讀長較次世代定序長
C就每個鹼基而言，次世代定序費用較桑格定序高
D就資料分析而言，桑格定序較次世代定序複雜
詳細解析
本題觀念：
本題考點為傳統桑格定序（Sanger sequencing）與次世代定序（Next-Generation Sequencing, NGS）之比較。 這兩種技術是醫學檢驗中基因檢測的基石。雖然第三代定序（如 PacBio, Nanopore）具備長讀長特性，但在傳統考試與大多數臨床比較的語境中，「次世代定序（NGS）」通常指目前臨床主流的第二代定序（如 Illumina 平台），其特徵為「高通量、短讀長（Short reads）」。考生需掌握兩者在原理、讀長、成本及分析複雜度上的差異。
選項分析
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A. 兩者皆需建立文庫（library）：錯誤
- NGS：必須建立文庫。過程包括將 DNA 片段化、加上轉接子（adapters）與索引（indices），這是 NGS 的核心步驟。
- 桑格定序：通常不需要建立文庫。它直接對 PCR 產物或質體進行定序，只需單一引物（primer）結合至模板即可進行反應。雖然早期的全基因組定序（如人類基因組計畫）會使用細菌人工染色體（BAC）文庫配合桑格定序，但在現代臨床檢驗的語境下（如單一基因變異確認），桑格定序不涉及文庫製備。
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B. 就單一片段而言，桑格定序讀長較次世代定序長：正確
- 桑格定序：讀長（Read length）較長，通常可達 500 ~ 1,000 bp（平均約 800 bp）。這使其成為驗證長片段或跨越重複序列區域的黃金標準。
- NGS（第二代）：主流平台（如 Illumina）屬於短讀長技術（Short-read sequencing），單一讀長通常僅 150 ~ 300 bp（雖然可透過 Paired-end 技術拼接，但原始讀值仍短）。
- 註：雖第三代定序（Long-read NGS）讀長可達 10kb 以上，但在「桑格 vs NGS」的典型比較題中，NGS 預設指短讀長技術。
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C. 就每個鹼基而言，次世代定序費用較桑格定序高：錯誤
- NGS：具有「大規模平行定序」的特性，一次能產出數十億個鹼基，因此單位鹼基成本（Cost per base）極低。
- 桑格定序：雖然單次反應（Per reaction）的絕對金額便宜（適合做單一確認），但因通量低，其單位鹼基成本遠高於 NGS。
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D. 就資料分析而言，桑格定序較次世代定序複雜：錯誤
- NGS：產生的數據量龐大（GB 至 TB 等級），需要複雜的生物資訊流程（Bioinformatics pipeline）進行序列比對（Alignment）、變異呼叫（Variant calling）及註釋，分析門檻極高。
- 桑格定序：產生的是簡單的層析圖（Chromatogram），通常僅需目視檢查或簡單軟體即可判讀，分析相對簡單。
答案解析
正確答案為 B。 在傳統與臨床檢驗的比較架構下，桑格定序的優勢在於單一讀長較長（500-1000 bp vs NGS 的 150-300 bp）且準確度極高（由其是對於單一序列），常被用作 NGS 檢測結果的驗證工具（Gold Standard）。
核心知識點
考生應對照記憶以下特徵：
| 特徵 | 桑格定序 (Sanger) | 次世代定序 (NGS, 2nd Gen) |
|---|---|---|
| 核心原理 | 雙去氧鏈終止法 (Chain termination) | 大規模平行定序 / 邊合成邊定序 (SBS) |
| 通量 (Throughput) | 低 (一次一個片段) | 極高 (一次數百萬片段) |
| 讀長 (Read Length) | 長 (約 800-1000 bp) | 短 (約 150-300 bp) |
| 單位鹼基成本 | 高 | 低 |
| 文庫製備 (Library) | 通常不需要 | 必須 |
| 資料分析 | 簡單 (層析圖) | 複雜 (需生物資訊) |
| 臨床應用 | 單基因疾病確診、NGS 結果驗證 | 癌症基因檢測面板 (Panel)、全外顯子/全基因組定序 |
新政策/指引改變 (2024-2026 重點)
- 健保給付 NGS：台灣衛福部健保署已於 2024 年 5 月 1 日起，正式將次世代基因定序（NGS）納入健保給付，主要針對癌症（如肺癌、乳癌、大腸直腸癌等 19 類癌別）。
- 檢測類別：分為 BRCA1/2、小套組（<100 基因）、大套組（>100 基因）等不同給付模式。
- 醫檢師角色：醫檢師需了解 NGS 的實驗流程品管（QC）及相關法規（LDTs, 特管辦法），此為近期國考熱門趨勢。