關於桑格定序法（ Sanger sequencing ）分析的敘述，下列何者錯誤？

本題觀念：

本題考查**桑格定序法（Sanger sequencing）的品質控制（Quality Control）與引子設計（Primer Design）**原則。核心概念在於了解定序反應的有效讀取範圍（Read length）、訊號特徵以及臨床判讀的標準作業程序。

選項分析

• A. G、A、 T、 C的訊號高度不適合作為核苷酸相對比例的標準：正確

  • 桑格定序使用四種不同的螢光染料標定 ddNTP。由於不同染料的量子產率（Quantum yield）與螢光強度不同，且 DNA 聚合酶對不同核苷酸的結合效率也會受到序列環境（Sequence context）影響，因此不同鹼基的波峰高度（Peak height）並不具有絕對的定量線性關係。
  • 雖然在異合子（Heterozygote）檢測中，我們會觀察同一位置是否有高度減半的雙峰（Double peaks），但在不同位置或不同鹼基之間，訊號高度不能直接作為核苷酸濃度的絕對定量標準。

• B. 檢測的變異位點愈靠近 sequencing primer 愈好：錯誤

  • 這是本題的正確答案。
  • 桑格定序在引子（Primer）之後的前 15~50 個鹼基（bases），常因未反應的染料團

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