115年:(醫檢)檢驗(2)

下列那種溶液常用於傳統的Southern blotting,可透過毛細作用將DNA 轉漬(transfer)到硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane)上?

Aphosphate-buffered saline(PBS)
Bsaline sodium citrate(SSC)
CTris acetate EDTA(TAE)
DTris-EDTA(TE)

詳細解析

本題觀念

Southern blotting是分子生物學中用來偵測特定DNA片段的重要技術,其流程包含限制酶切割、洋菜膠電泳分離、將DNA轉漬(transfer)到固相支持膜上,最後以標記探針進行雜合偵測。整個實驗流程中,不同步驟會使用不同性質的緩衝液,各自對應電泳分離、轉漬固定或樣本保存等不同功能,正確分辨這些緩衝液各自的適用階段,是本題考核的重點。

傳統Southern blotting的轉漬步驟,是利用毛細作用(capillary action)讓高鹽緩衝液持續流經洋菜膠,把已經電泳分離好的DNA片段帶往硝酸纖維素膜或尼龍膜,並使DNA吸附固定在膜上。這個階段所使用的緩衝液,必須具備足夠高的離子強度,才能中和DNA磷酸骨架上的負電荷,讓DNA分子穩定吸附於膜的表面,而不會隨著液流繼續遷移流失。

選項分析

A:phosphate-buffered saline(PBS)是以磷酸鹽緩衝的生理食鹽水,主要應用在免疫學相關實驗,例如Western blot的膜清洗步驟、抗體稀釋或細胞培養沖洗,並非用於Southern blot毛細轉漬DNA的緩衝液,此選項不正確。

B:saline sodium citrate(SSC)是由氯化鈉與檸檬酸鈉組成的高鹽緩衝液,傳統上以20倍濃度(20x SSC)配製、稀釋使用,其高離子強度可中和DNA磷酸骨架的負電荷,促進DNA在毛細轉漬過程中穩定吸附並固定於硝酸纖維素膜上,是傳統Southern blotting轉漬步驟的標準緩衝液,此選項正確,為本題答案。

C:Tris acetate EDTA(TAE)是洋菜膠電泳最常使用的跑膠緩衝液,功能是在電泳過程中維持適當的離子強度與pH,讓DNA片段依分子量大小分離,作用階段是電泳分離而非轉漬到膜上,此選項不正確。

D:Tris-EDTA(TE)是DNA樣本的標準儲存緩衝液,其中Tris維持pH穩定、EDTA螯合二價陽離子以抑制核酸酶活性,主要用於溶解與長期保存DNA,並非用於毛細轉漬到膜上的高鹽緩衝液,此選項不正確。

答案解析

本題答案為B。Southern blotting的完整流程中,各緩衝液各司其職:TAE負責電泳分離階段,維持適當的離子強度與pH讓DNA片段依大小分離;TE則是實驗前後用於溶解與保存DNA樣本的緩衝液;PBS主要見於免疫學相關的清洗與稀釋用途。唯有SSC具備轉漬步驟所需的高離子強度,能有效中和DNA磷酸骨架的負電荷,使DNA片段在毛細作用帶動下,穩定吸附並固定於硝酸纖維素膜或尼龍膜上,因此SSC才是傳統Southern blotting轉漬階段所使用的標準緩衝液。

核心知識點

Southern blotting實驗流程中的緩衝液選用可歸納為:電泳分離階段使用TAE(或TBE)跑膠緩衝液;轉漬階段使用高鹽的SSC緩衝液,藉由毛細作用將DNA轉移並固定到硝酸纖維素膜或尼龍膜上;DNA樣本的保存則使用TE緩衝液;PBS則多用於免疫學相關的清洗與稀釋,與Southern blot的DNA轉漬無直接關聯。清楚分辨這些緩衝液各自對應的實驗階段與作用機轉,是掌握Southern blotting原理與實務操作的基礎。

參考資料

  1. Southern Blotting Protocol - Conduct Science
  2. Southern Blot - Microbe Notes
  3. Southern Blotting - MyBioSource
  4. SSC buffer - Wikipedia
  5. Southern and Northern Blotting - Sigma-Aldrich