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115年:(醫檢)生化(2)

下列那一個技術不屬於高通量定序（massively parallel sequencing）或次世代定序（next-generation sequencing）？

Ananopore sequencing
Bsingle molecule sequencing
CSanger sequencing
Dsemiconductor sequencing

詳細解析

本題觀念

高通量定序（massively parallel sequencing, MPS）又稱次世代定序（next-generation sequencing, NGS），是利用大規模平行處理的概念同時對數百萬至數十億條 DNA 片段進行定序的技術總稱。NGS 依發展歷程可分為第二代（如 Illumina、Ion Torrent）與第三代（如 PacBio SMRT、Oxford Nanopore）平台，兩者共同特徵是具備高通量、平行處理的定序能力。相對於此，第一代定序技術（Sanger sequencing）每次僅能處理單一 DNA 片段，不具備大規模平行定序的能力，與 NGS/MPS 在定義上截然不同。本題要求辨別哪一項技術不屬於 NGS/MPS 的範疇。

選項分析

A：Nanopore sequencing（奈米孔定序）由 Oxford Nanopore Technologies 開發，屬第三代定序技術。其原理為 DNA 分子通過蛋白質奈米孔時，不同核苷酸造成離子電流的特徵性變化，藉此即時判讀序列。Nanopore 定序可讀取超長片段（數十 kb 至 Mb 等級），且能直接偵測 DNA 甲基化修飾。MPS 技術範例明確涵蓋 nanopore sequencing，屬於 NGS/MPS 範疇。

B：Single molecule sequencing（單分子定序）包括 PacBio 的 SMRT（single molecule real-time）定序與 Helicos 的 Helioscope 平台。這些技術直接對單一 DNA 分子進行即時定序，無需 PCR 擴增步驟，因此可避免擴增偏差並保留原始甲基化資訊。MPS 技術範例明確涵蓋 SMRT sequencing 與 Helioscope single molecule sequencing，屬第三代 NGS/MPS 技術。

C：Sanger sequencing（桑格定序）為第一代定序技術，由 Frederick Sanger 於 1977 年開發。其原理為利用螢光標記的雙脫氧核苷酸（ddNTPs）隨機終止 DNA 聚合反應，再以毛細管電泳分離片段並判讀序列。Sanger 定序每次僅能處理單一短片段（通常小於 700 bp），不具備大規模平行處理的能力，因此不屬於高通量定序或次世代定序的範疇。此為正確答案。

D：Semiconductor sequencing（半導體定序）為 Ion Torrent 平台所採用的技術，屬第二代 NGS 平台。其原理為偵測核苷酸聚合時釋放的氫離子（H+）所造成的 pH 變化，以半導體晶片取代光學偵測，實現高速定序。MPS 技術範例明確涵蓋 Ion semiconductor sequencing，屬於 NGS/MPS 範疇。

答案解析

本題答案為 C。選項 A 的 nanopore sequencing（第三代）、選項 B 的 single molecule sequencing（第三代）與選項 D 的 semiconductor sequencing（第二代）皆為高通量定序平台，屬 NGS/MPS 技術。唯有選項 C 的 Sanger sequencing 為第一代定序技術，每次僅處理單一片段，不具備大規模平行處理的能力，不屬於 NGS/MPS。

核心知識點

定序技術依世代可分為三類：第一代為 Sanger 定序（鏈終止法，低通量，單一片段），第二代為 Illumina（合成定序）與 Ion Torrent（半導體定序）等短讀取 NGS 平台，第三代為 PacBio SMRT 與 Oxford Nanopore 等長讀取單分子即時定序平台。第二代與第三代統稱為 NGS 或 MPS，核心共同點為具備高通量、大規模平行定序的能力。Sanger 定序雖然仍廣泛用於驗證性定序與小規模分析，但因缺乏平行處理能力而不歸類為 NGS/MPS。

參考資料

  1. Massively parallel sequencing. https://en.wikipedia.org/wiki/Massively_parallel_sequencing
  2. Sanger Sequencing vs Next-Generation Sequencing. CD Genomics. https://www.cd-genomics.com/resource-sanger-sequencing-vs-next-generation-sequencing.html
  3. Advances in Next-Generation Sequencing Technologies. PMC. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12153771/
  4. A Review of Next Generation Sequencing Methods and Its Applications. Microbiology Journal. https://microbiologyjournal.org/a-review-of-next-generation-sequencing-methods-and-its-applications-in-laboratory-diagnosis/
  5. Next-Generation Sequencing - BC Campus. https://pressbooks.bccampus.ca/kathleef/chapter/11-next-generation-sequencing/
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